กระบวนการสุดท้ายในการเตรียม NGS library นั่นคือ การปรับความเข้มข้นของ DNA Libraries จากหลายๆ ตัวอย่างให้มีความเข้มข้นสุดท้ายเท่ากันที่ 4 nmol/L ก่อนรวมทุกตัวอย่างเข้ากัน และโหลดเข้าสู่เครื่องอ่านลำดับต่อไป โดยวิธีการแบบดั้งเดิมนั้นใช้เทคนิค Fluorometer หรือ qPCR ในการวัดความเข้มข้นของตัวอย่างแต่ละตัว จากนั้นคำนวณความเข้มข้นแล้วทำการเจือจางตัวอย่างให้ได้ตามความเข้นข้นที่ต้องการ ซึ่งขั้นตอนเหล่านี้อาจใช้เวลาตั้งแต่หนึ่งจนถึงหลายชั่วโมง ขึ้นอยู่กับเทคนิคการวัดปริมาณที่เลือกใช้ และจำนวนของตัวอย่าง

   โดยการใช้งาน QIAseq Normalizer Kit คุณสามารถรวม libraries ต่างๆ ได้ง่ายขึ้นโดยไม่จำเป็นต้องวัดปริมาณ และยังคงได้ความแม่นยำเทียบเท่ากับการใช้ qPCR ด้วยเวลาเพียง 30 นาทีเท่านั้น และสามารถเข้ากันได้กับชุดเตรียม Libraries ทุกยี่ห้อสำหรับแพลตฟอร์ม Illumina ซึ่งรวมถึงของแบรนด์ QIAGEN และ Third party อื่นๆ ด้วยเช่นกัน

รูปที่ 1 ผลลัพธ์ libraries จากการใช้ QIAseq Normalizer kit

5 เหตุผลที่เลือก QIAseq Normalizer kit แทนการวัดปริมาณ libraries แบบดั้งเดิม

1. ทำให้ libraries เป็นมาตรฐานเท่ากันที่ 4 nmol/L และพร้อมสำหรับการทำ sequence
2. ใช้เวลาเตรียมเพียง 30 นาที
3. คุณภาพเป็นมาตรฐานเทียบเท่าเทคนิค qPCR
4. ใช้งานได้กับช่วงความเข้มข้นที่หลากหลายตั้งแต่ 15 ถึงมากกว่า 300 nmol/L
5. เข้ากันได้กับ libraries ประเภทต่างๆ เช่น whole genome, whole transcriptome และ target-enriched libraries

รูปที่ 2 เปรียบเทียบขั้นตอนแบบดั้งเดิม และการใช้ QIAseq Normalizer สำหรับเตรียม libraries ก่อนการ sequence

 

หลักการภายใต้ QIAseq Normalizer kits

    ชุด QIAseq Normalizer ใช้ไพรเมอร์ และสารเคมีเพื่อดัดแปลงปลายทั้งสองด้านของ libraries และใช้ Magnetic beads ที่มีประสิทธิภาพในการจับกับ libraries อย่างแม่นยำที่ 4 nmol/L จับและปล่อยโมเลกุล libraries ตามจำนวนที่กำหนด dsDNA ที่ได้การจาก eluted อยู่ในรูป non-denaturing ที่พร้อมสำหรับการอ่านลำดับพันธุกรรม หรือสามารถจัดเก็บในระยะยาวได้ที่ -20 °C

 

ขั้นตอนการใช้งาน

1. เตรียมความพร้อมของ libraries สำหรับการทำ normalization โดยการใช้ primer mix ดัดแปลงโมเลกุล libraries ที่บริเวณปลายทั้งสองด้าน
2. ผสม modified libraries เพื่อเข้าจับกับ normalized beads
3. ใช้ Wash buffer เพื่อชะล้างโมเลกุล libraries ส่วนเกินที่ไม่ได้จับเม็ด bead ออก
4. ใช้ Elution buffer เฉพาะ เพื่อ Elute โมเลกุล libraries ออกจากเม็ด bead ด้วยปริมาณ 4 nmol/L อย่างแม่นยำ

รูปที่ 3 หลักการ และขั้นตอนการใช้ QIAseq Normalizer kit

การประยุกต์ใช้งาน

Normalized libraries ที่เตรียมด้วยชุด QIAseq Normalizer นั้นพร้อมโดยตรงสำหรับการอ่านลำดับบนเครื่องของ Illumina

ชุด QIAseq Normalizer เข้ากันได้กับชุดการเตรียม QIAseq library kits ทั้งหมดและชุดการเตรียม library ของบริษัทอื่นเกือบทั้งหมด ตราบใดที่ไม่ได้มีไว้สำหรับการทำ Hybrid capture ภายหลัง

 

ข้อมูลสินค้าที่เกี่ยวข้อง https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/next-generation-sequencing/qiaseq-library-normalization?catno=180603

สนใจสอบถามรายละเอียดเพิ่มเติม

ติดต่อ Info@biodesign.co.th หรือ Line: @BioDesign หรือ https://www.facebook.com/BioDesignTH

 

บทความโดย: อนาวิล วงศ์ศฤงคาร

ตำแหน่ง: Product Specialist บริษัท ไบโอดีไซน์ จำกัด