กระบวนการสุดท้ายในการเตรียม NGS library นั่นคือ การปรับความเข้มข้นของ DNA Libraries จากหลายๆ ตัวอย่างให้มีความเข้มข้นสุดท้ายเท่ากันที่ 4 nmol/L ก่อนรวมทุกตัวอย่างเข้ากัน และโหลดเข้าสู่เครื่องอ่านลำดับต่อไป โดยวิธีการแบบดั้งเดิมนั้นใช้เทคนิค Fluorometer หรือ qPCR ในการวัดความเข้มข้นของตัวอย่างแต่ละตัว จากนั้นคำนวณความเข้มข้นแล้วทำการเจือจางตัวอย่างให้ได้ตามความเข้นข้นที่ต้องการ ซึ่งขั้นตอนเหล่านี้อาจใช้เวลาตั้งแต่หนึ่งจนถึงหลายชั่วโมง ขึ้นอยู่กับเทคนิคการวัดปริมาณที่เลือกใช้ และจำนวนของตัวอย่าง
โดยการใช้งาน QIAseq Normalizer Kit คุณสามารถรวม libraries ต่างๆ ได้ง่ายขึ้นโดยไม่จำเป็นต้องวัดปริมาณ และยังคงได้ความแม่นยำเทียบเท่ากับการใช้ qPCR ด้วยเวลาเพียง 30 นาทีเท่านั้น และสามารถเข้ากันได้กับชุดเตรียม Libraries ทุกยี่ห้อสำหรับแพลตฟอร์ม Illumina ซึ่งรวมถึงของแบรนด์ QIAGEN และ Third party อื่นๆ ด้วยเช่นกัน
รูปที่ 1 ผลลัพธ์ libraries จากการใช้ QIAseq Normalizer kit
5 เหตุผลที่เลือก QIAseq Normalizer kit แทนการวัดปริมาณ libraries แบบดั้งเดิม
- ทำให้ libraries เป็นมาตรฐานเท่ากันที่ 4 nmol/L และพร้อมสำหรับการทำ sequence
- ใช้เวลาเตรียมเพียง 30 นาที
- คุณภาพเป็นมาตรฐานเทียบเท่าเทคนิค qPCR
- ใช้งานได้กับช่วงความเข้มข้นที่หลากหลายตั้งแต่ 15 ถึงมากกว่า 300 nmol/L
- เข้ากันได้กับ libraries ประเภทต่างๆ เช่น whole genome, whole transcriptome และ target-enriched libraries
รูปที่ 2 เปรียบเทียบขั้นตอนแบบดั้งเดิม และการใช้ QIAseq Normalizer สำหรับเตรียม libraries ก่อนการ sequence
หลักการภายใต้ QIAseq Normalizer kits
ชุด QIAseq Normalizer ใช้ไพรเมอร์ และสารเคมีเพื่อดัดแปลงปลายทั้งสองด้านของ libraries และใช้ Magnetic beads ที่มีประสิทธิภาพในการจับกับ libraries อย่างแม่นยำที่ 4 nmol/L จับและปล่อยโมเลกุล libraries ตามจำนวนที่กำหนด dsDNA ที่ได้การจาก eluted อยู่ในรูป non-denaturing ที่พร้อมสำหรับการอ่านลำดับพันธุกรรม หรือสามารถจัดเก็บในระยะยาวได้ที่ -20 °C
ขั้นตอนการใช้งาน
- เตรียมความพร้อมของ libraries สำหรับการทำ normalization โดยการใช้ primer mix ดัดแปลงโมเลกุล libraries ที่บริเวณปลายทั้งสองด้าน
- ผสม modified libraries เพื่อเข้าจับกับ normalized beads
- ใช้ Wash buffer เพื่อชะล้างโมเลกุล libraries ส่วนเกินที่ไม่ได้จับเม็ด bead ออก
- ใช้ Elution buffer เฉพาะ เพื่อ Elute โมเลกุล libraries ออกจากเม็ด bead ด้วยปริมาณ 4 nmol/L อย่างแม่นยำ
รูปที่ 3 หลักการ และขั้นตอนการใช้ QIAseq Normalizer kit
การประยุกต์ใช้งาน
Normalized libraries ที่เตรียมด้วยชุด QIAseq Normalizer นั้นพร้อมโดยตรงสำหรับการอ่านลำดับบนเครื่องของ Illumina
ชุด QIAseq Normalizer เข้ากันได้กับชุดการเตรียม QIAseq library kits ทั้งหมดและชุดการเตรียม library ของบริษัทอื่นเกือบทั้งหมด ตราบใดที่ไม่ได้มีไว้สำหรับการทำ Hybrid capture ภายหลัง
ข้อมูลสินค้าที่เกี่ยวข้อง https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/next-generation-sequencing/qiaseq-library-normalization?catno=180603
สนใจสอบถามรายละเอียดเพิ่มเติม
ติดต่อ Info@biodesign.co.th หรือ Line: @BioDesign หรือ https://www.facebook.com/BioDesignTH
บทความโดย: อนาวิล วงศ์ศฤงคาร
ตำแหน่ง: Product Specialist บริษัท ไบโอดีไซน์ จำกัด