เทคนิค Isothermal Amplification เป็นเทคนิคทาง molecular อีกวิธีหนึ่งที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณสารพันธุรรม โดยใช้อุณหภูมิคงที่อยู่ที่ประมาณ 60-70 องศาเซลเซียส ซึ่งแตกต่างจากเทคนิค polymerase chain reaction (PCR) ที่ต้องใช้การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิไปมาแต่ละรอบของปฎิกิยา โดยเทคนิค Isothermal Amplification จะใช้เอนไซม์ DNA polymerase ชนิดที่มีความสามารถสังเคราะห์สายดีเอ็นเอใหม่ได้ในขณะที่แทนที่สายดีเอ็นเอที่มีอยู่เดิมไปพร้อมกัน (strand displacement activity)  ตัวอย่างเช่น Bst DNA polymerase, Pfu DNA polymerase และ Taq DNA polymerase เป็นต้น

    Isothermal Amplification สามารถแบ่งเป็นเทคนิคย่อยๆ ได้หลายเทคนิค ตัวอย่างเช่น

• Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): LAMP เป็นเทคนิคที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลาย ซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีในเรื่องความง่าย ความรวดเร็ว และความไว โดยปฏิกิริยา LAMP ทำงานโดยใช้ primer 4 – 6 คู่ ที่จำเพาะกับดีเอ็นเอเป้าหมาย ทำให้ LAMP เป็นเทคนิคที่มีความจำเพาะและไวมาก ซึ่งทั่วไปใช้เวลาเพียง 15-30 นาทีเท่านั้น

รูปที่ 1 ตัวอย่าง LAMP workflow: โดยมี primer ทั้งหมด 4 คู่ ได้แก่ Forward outer primer (F3), Backward outer primer (B3), Forward internal primer (FIP), Backward internal primer (BIP) (Salamin et al., 2017)

เมื่อเสร็จสิ้นปฏิกิริยา LAMP แล้ว สามารถตรวจวัดผลที่เกิดขึ้นได้โดยใช้วิธีต่างๆ เช่น วัดปริมาณแสง Fluorescent ดูปริมาณสีที่เกิดขึ้น วัดความขุ่น หรือวัดผลจาก lateral flow และเนื่องจากการทำ LAMP สามารถวัดผลได้หลายวิธี ทำให้ LAMP สามารถประยุกต์ใช้กับงานด้านต่างๆ ได้หลากหลาย

• Helicase-dependent amplification (HDA): เป็นเทคนิคที่อาศัยเอนไซม์ helicase ในการแยกสายดีเอ็นเอออกเป็นสองสาย แล้วใช้เอนไซม์ DNA polymerase ในการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอใหม่ โดยเทคนิค HDA จะทำงานที่อุณหภูมิช่วง 60-65 องศาเซลเซียส
• Rolling circle amplification (RCA): เป็นเทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณ circulating nucleic acid ทั้ง DNA และ RNA เช่น plasmid, genome ของ bacteriophage, RNA virus เป็นต้น

    การใช้ Isothermal Amplification มีข้อดีกว่าใช้เทคนิค PCR ปกติ เช่น:

• ใช้งานง่าย: เนื่องจากปฏิกิริยา Isothermal Amplification ใช้เพียงแค่อุณหภูมิเดียวในการทำปฏิกิริยา จึงไม่ต้องอาศัยเครื่อง thermal cycler ในการทำเพียงอย่างเดียว
• ระยะเวลาน้อย: การทำ Isothermal Amplification โดยทั่วไปเร็วกว่าปฏิกิริยา PCR มาก โดยใช้เวลาเพียง 15-30 นาทีเท่านั้น
• ความไว: ปฏิกิริยา Isothermal Amplification มีความไวสูงและสามารถใช้เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมได้ แม้จะมีปริมาณตัวอย่างน้อยมากก็ตาม

    ในการศึกษาด้วยเทคนิคเหล่านี้จะต้องมีการเลือกใช้น้ำยาให้เหมาะสมกับเทคนิคที่เราเลือกใช้ โดยสามารถใช้ร่วมกับน้ำยา IsoFast™ Hot Start Bst Polymerase Colour & Mix ซึ่งเป็นน้ำยาจากบริษัท PCR Biosystem ประเทศอังกฤษ โดยน้ำยากลุ่มนี้จะมีเอนไซม์ Bst DNA polymerase เป็นเอนไซม์หลักในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม และทำงานร่วมกับ pH-based dye ที่ช่วยให้เห็นผลการทดลองได้เลยเมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยา จากสีที่เปลี่ยนแปลงไป อีกทั้งยังมีเทคโนโลยี AptaLock™ ที่จะช่วยให้สามารถตรวจหา DNA target ได้ไวขึ้น มีความแม่นยำมากยิ่งขึ้น ช่วยลดการเกิด primer dimer และยังช่วยลดการเกิด non-specific amplification ได้อีกด้วย

Key features:

• เมื่อสิ้นสุดปฏิกิริยาสามารถทราบผลการทดลองได้เลย จากสีของปฏิกิริยาที่เปลี่ยนแปลงไป
• มีเทคโนโลยี AptaLock™ hot start ซึ่งช่วยเพิ่มความไวในการตรวจจับ DNA เป้าหมาย
• เพิ่มปริมาณ DNA ได้อย่างรวดเร็ว สามารถได้รับผลจากทดลองจากปฏิกิริยาเพียง 10 นาที
• สามารถตรวจหา DNA เป้าหมายได้ แม้มีปริมาณ DNA ตั้งต้นเพียง 3 copies/µl
• สามารถเตรียมปฏิกิริยาได้ในอุณหภูมิห้อง โดยไม่จำเป็นต้องเตรียมในอุณหภูมิเย็นเท่านั้น
• น้ำยาสามารถทำงานได้ตั้งแต่อุณหภูมิ 55 – 70 องสาเซลเซียส

รูปที่ 2 IsoFast™ Hot Start Bst Polymerase Colour & Mix: Colorimetric readout

รูปที่ 3 น้ำยา IsoFast™ Hot Start Bst Polymerase Colour & Mix

    โดยนักวิจัยสามารถนำเทคนิค Isothermal Amplification มาประยุกต์ใช้ในงานวิจัยค่อนข้างหลากหลายไม่ว่าจะเป็น การตรวจหาเชื้อก่อโรคต่างๆ ในคนไข้ การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การตรวจหายีนกลายพันธุ์ ตรวจหาเชื้อโรคที่ปนเปื้อนในอาหาร หรือสิ่งแวดล้อม เป็นต้น ซึ่งเทคนิค Isothermal Amplification นี้เองจะช่วยให้นักวิจัยทำงานได้อย่างรวดเร็ว และแม่นยำมากยิ่งขึ้น

Ordering information

Product	Size	Cat No./ID:
IsoFast™ Hot Start Bst Polymerase Colour	1600 Units	PB80.50-01
IsoFast™ Hot Start Bst Polymerase Colour	8000 Units	PB80.50-08
IsoFast™ Hot Start Bst Colour Mix	100 x 25 µL Reactions	PB80.51-01
IsoFast™ Hot Start Bst Colour Mix	500 x 25 µL Reactions	PB80.51-05

 

สนใจสอบถามรายละเอียดเพิ่มเติม

ติดต่อ Info@biodesign.co.th หรือ Line: @BioDesign หรือ https://www.facebook.com/BioDesignTH

 

“บทความผลิตภัณฑ์โดย คุณอัจฉริยา พรหมจรรยา Product Specialist บริษัท ไบโอดีไซน์ จำกัด”