การวิเคราะห์แบบ High Resolution Melting (HRM) เป็นเทคนิคที่เกิดขึ้นหลังการทำ Real-time PCR ที่สามารถใช้ในการระบุการเปลี่ยนแปลงของลำดับดีเอ็นเอที่ต้องการศึกษา เป็นเทคนิคที่ใช้ในตรวจสอบได้ไว มีความจำเพาะ และสามารถทำได้ง่าย โดยสามารถใช้ตรวจหาความแปรผันของ DNA ได้หลากหลาย ทำให้เหมาะสำหรับไปประยุกต์ใช้กับงานวิจัยและการใช้งานทางคลินิก

    การศึกษาโดยเทคนิค HRM อาศัยหลักการแยกสายของดีเอ็นเอสายคู่ (dsDNA) โดยแต่ละสาย DNA ที่มีลำดับเบสต่างกันจะมีอุณหภูมิที่ใช้ในการแยกสายแตกต่างกัน (Melting temperature: Tm) โดยปริมาณเบส GC จะเป็นปัจจัยหลักในการกำหนดอุณหภูมิ หาก DNA มีปริมาณ GC สูงจะใช้อุณหภูมิสูง นอกจากนี้ปัจจัยอื่นๆ เช่น ความยาวของโมเลกุล dsDNA และการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสในสาย DNA นั้นๆ ก็สามารถส่งผลต่ออุณหภูมิในการแยกสาย DNA นี้ได้เช่นกัน ซึ่งในการวิเคราะห์แบบ HRM จะวิเคราะห์โดยใช้เครื่อง real-time PCR หลังจากการทำ PCR เมื่อมีการเพิ่มปริมาณ DNA แล้ว สามารถตั้งค่าอุณหภูมิค่อยๆเพิ่มขึ้น และสาย dsDNA จะเริ่มแยกสาย โดยค่า Tm ของ PCR product คือค่าอุณหภูมิที่โมเลกุล dsDNA แยกออกจากกัน 50%

    การวิเคราะห์แบบ HRM สามารถใช้เพื่อตรวจหาความแปรปรวนทางพันธุกรรมได้หลากหลาย ไม่ว่าจะเป็นการศึกษา single nucleotide polymorphisms (SNPs) การเกิด mutation หรือเกิด DNA methylation ซึ่งเป็นการเปลี่ยนแปลงของทางเคมีของ DNA ที่สามารถส่งผลต่อการแสดงออกของยีนได้ เป็นต้น ในการตรวจหาการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสเหล่านี้ ด้วยเทคนิค HRM มักจะมีการออกแบบคู่ primer ที่ครอบคลุมตำแหน่งเบสของที่ต้องการตรวจสอบ หากมีการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสอยู่ใน PCR product จะส่งผลให้ค่า Tm ของ PCR product เปลี่ยนไปเล็กน้อย และการเปลี่ยนแปลงนี้สามารถตรวจพบได้โดยเครื่อง real-time PCR และแสดงกราฟค่า Tm ที่แตกต่างกันออกไป

รูปที่1 การตรวจหา SNPs ด้วยเทคนิค HRM

 

รูปที่2 การตรวจหาระดับ DNA Methylation (0% – 100%) ของตัวอย่าง Genomic DNA ด้วยเทคนิค HRM

 

ข้อดีการศึกษาการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสด้วยเทคนิค HRM ได้แก่

• เป็นเทคนิคที่มีความไวสูงและมีความจำเพราะในการตรวจหาความแปรผันทางพันธุกรรม

• ทำได้ง่านและรวดเร็ว

• สามารถใช้ตรวจจับความแปรผันทางพันธุกรรมได้หลากหลาย เช่น SNP Genotyping การเกิดการกลายพันธุ์  การเกิด DNA Methylation และ DNA Fingerprinting เป็นต้น

• ค่าใช้จ่ายในการทำไม่สูง

    ในการศึกษาด้วยเทคนิค HRM สามารถใช้ร่วมกับน้ำยา Clara™ HRM Mix ซึ่งน้ำยามีสีฟลูออเรสเซนต์ในกลุ่ม intercalating dye ได้แก่ SyGreen 2 ซึ่งสามารถให้ผลการทดลองที่แม่นยำ และยังมีคุณสมบัติในการช่วยลดผลของ PCR inhibitor ที่ปนเปื้อนอยู่ตัวอย่างที่ต้องการศึกษา โดยน้ำยานี้เป็นผลิตภัณฑ์จากบริษัท PCR Biosystems ประเทศอังกฤษ

 

Ordering information

Product	Size	Cat No./ID:
Clara™ HRM Mix	100 x 20 µL Reactions	PB20.32-01
Clara™ HRM Mix	500 x 20 µL Reactions	PB20.32-05
Clara™ HRM Mix	2000 x 20 µL Reactions	PB20.32-20