การตรวจวิเคราะห์คุณภาพและปริมาณ DNA และ RNA
รูปที่ 1 โครงสร้าง DNA และ RNA
การศึกษาเกี่ยวกับพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตนั้นแม้จะเป็นการศึกษาที่มีมายาวนานแล้ว แต่ยังคงสามารถใช้ตอบโจทย์งานวิจัยปัจจุบันได้เป็นอย่างดี ไม่ว่าจะเป็น การศึกษาการแสดงออกของยีนในสิ่งมีชีวิต (Gene expression), การศึกษาสิ่งมีชีวิตในสภาพแวดล้อมที่สนใจ (Microbiome), การตัดต่อพันธุกรรมในพืชเพื่อปรับแต่งสายพันธุ์ (GMO), การค้นคว้าหายาตัวใหม่ (Drug discovery), การพิสูจน์หลักฐานทางนิติวิทยาศาสตร์ (Forensic science), การวินิจฉัยโรค (Diagnostic) จนถึงการรักษาด้วยยีน (Gene therapy) และการศึกษาในอีกหลากหลายด้านที่เพิ่มขึ้นมาอย่างต่อเนื่อง
ปัจจัยหลักที่มีผลต่อการศึกษาเกี่ยวกับพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตนั้นย่อมเป็น คุณภาพ และปริมาณ ของ DNA หรือ RNA ที่สกัดได้จากตัวอย่าง
โดยการวัดปริมาณ (Quantity) สามารถทำได้ดังนี้
-
การวัดค่าการดูดกลืนแสง (absorbance) ด้วย UV-VIS spectrophotometry
เป็นการวัด ปริมาณการดูดกลืนแสงของ nucleic acid (DNA และ RNA) ที่ความยาวคลื่น 260 nm ซึ่งเป็นช่วงที่ DNA และ RNA สามารถดูดกลืนแสงได้มากที่สุด โดยจะค่าอยู่ในช่วง 0.1-1 และสามารถคำนวณเป็นปริมาณได้ดังนี้
ความเข้มข้นของ dsDNA (ug/ml) = 50 ug/ml x dilution factor x ค่าการดูดกลืนแสง A260
ความเข้มข้นของ RNA (ug/ml) = 40 ug/ml x dilution factor x ค่าการดูดกลืนแสง A260
ความเข้มข้นของ Oligonucleotides (ug/ml) = 33 ug/ml x dilution factor x ค่าการดูดกลืนแสง A260
-
การวัดการเปล่งแสงของสีฟลูออเรสเซนต์ (Fluorescence dyes) ด้วย Fluorospectrometer
เป็นการใช้หลักการที่สีฟลูออเรสเซนต์จะเข้าไปจับกับสารพันธุกรรมเป้าหมายอย่างจำเพาะ และจะถูกกระตุ้นให้เปล่งแสงออกมา ค่าการเปล่งแสงของตัวอย่างที่ได้จะถูกเอาไปเทียบกับกราฟของค่าการเปล่งแสงของสารพันธุกรรมมาตรฐานที่รู้ความเข้มข้นแน่นอน
-
การเปรียบเทียบความเข้มของแบน (Band Intensity) ด้วย Gel electrophoresis
เป็นการทำ Agarose gel electrophoresis หรือ Capillary gel electrophoresis แล้วเปรียบเทียบความเข้มของแบนตัวอย่างกับความเข้มของแบนสารพันธุกรรมมาตรฐานที่รู้ความเข้มข้นแน่นอน
สำหรับการวัดคุณภาพ (Quality) จะพิจารณาจาก
1. ความบริสุทธิ์ (Purity)
เป็นการตรวจวัด DNA หรือ RNA ว่ามีการปนเปื้อนสารชีวภาพต่างๆ อย่างเช่น Humic acid, Phenol, Salt รวมถึง Protein ต่างๆ ที่หลงเหลือจากการสกัดหรือไม่สามารถกำจัดออกไปได้หรือไม่ ซึ่งสิ่งปนเปื้อนเหล่านี้อาจจะส่งผลต่อปฏิกิริยาในการทดลองขั้นต่อไปได้
โดยใช้อัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ A260/A280 สำหรับวิเคราะห์สัดส่วนของ DNA, RNA และการปนเปื้อนของ Protein หรือ Phenol เนื่องจากโปรตีนสามารถดูดคืนแสงได้ที่ดีที่สุดที่ A280 โดย
การแปลผลเบื้องต้นเป็นดังนี้
- กรณีที่ A260/A280 อยู่ในช่วง 1.7-1.9 ถือว่า DNA มีความบริสุทธิ์
- กรณีที่ A260/A280 อยู่ในช่วง 1.9-2.1 ถือว่า RNA มีความบริสุทธิ์
- กรณีที่ A260/A280 อยู่ในช่วง 2.1 ขึ้นไป มีการปนเปื้อนของ Protein หรือ Phenol สูง
และใช้อัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ A260/A230 สำหรับวิเคราะห์การปนเปื้อนของสารอินทรีย์ต่างๆ ไม่ว่าจะเป็น Humic acid, Ethanol หรือ salt ต่างๆ หากอัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ A260/A230 มากกว่า 1.8 แสดงว่ามีการปนเปื้อน
รูปที่ 2 กราฟการวัดปริมาณ DNA หรือ RNA และวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ ด้วยเครื่อง QIAxpert
2.ความสมบูรณ์ (Integrity)
เป็นการทำ Agarose gel electrophoresis หรือ Capillary gel electrophoresis และตรวจวัดขนาดของ DNA หรือ RNA ซึ่งจะบอกได้ว่ายังคงมีความสมบูรณ์หรือมีการถูกย่อยสลายไปแล้ว
รูปที่ 3 การวิเคราะห์คุณภาพของ gDNA โดย QIAxcel Advance System
รูปที่ 4 การวิเคราะห์คุณภาพของ RNA โดย QIAxcel Advance System
รูปที่ 5 ตารางเปรียบเทียบเทคโนโลยีในการวิเคราะห์คุณภาพและปริมาณ
สินค้าที่เกี่ยวข้อง
QIAxpert (https://www.qiagen.com/th/products/instruments-and-automation/quality-control-fragment-analysis/qiaxpert-system/)
QIAxcel Advanced (https://www.qiagen.com/th/products/instruments-and-automation/quality-control-fragment-analysis/qiaxcel-advanced-system/)
เอกสารอ้างอิง
-
Haque, K.A., Pfeiffer, R.M., Beerman, M.B., Chanock, S.J., and Bergen, A.W. 2003. Performance of high-throughput DNA quantification methods. BMC Biotechnology, 3,20. DOI: 10.1186/1472-6750-3-20.
-
Sedlackova, T., Repiska, G., Celec, P., Szemes, T., and Minarik, G. 2013. Fragmentation of DNA affects the accuracy of the DNA quantitation by the commonly used methods. Biological Procedures Online, 15,5. http://doi.org/10.1186/1480-9222-15-5.
-
Schade, C. 2014. Quality Control: An Important Success Factor in Nucleic Acid-Based Analysis. American Laboratory Articles Website. www.americanlaboratory.com/914-Application-Notes/158842-Quality-Control-An-Important-Success-Factor-in-Nucleic-Acid-Based-Analysis.
สนใจสอบถามข้อมูลได้ที่
แผนก Technical Support E-mail: techsupport@biodesign.co.th หรือ Info@biodesign.co.th หรือ Line: @BioDesign หรือ https://www.facebook.com/BioDesignTH
“บทความผลิตภัณฑ์โดย Technical Support Team ”