Product Articles

การตรวจวิเคราะห์คุณภาพและปริมาณ DNA และ RNA

การตรวจวิเคราะห์คุณภาพและปริมาณ DNA และ RNA

รูปที่ 1 โครงสร้าง DNA และ RNA

          การศึกษาเกี่ยวกับพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตนั้นแม้จะเป็นการศึกษาที่มีมายาวนานแล้ว แต่ยังคงสามารถใช้ตอบโจทย์งานวิจัยปัจจุบันได้เป็นอย่างดี ไม่ว่าจะเป็น การศึกษาการแสดงออกของยีนในสิ่งมีชีวิต (Gene expression), การศึกษาสิ่งมีชีวิตในสภาพแวดล้อมที่สนใจ (Microbiome), การตัดต่อพันธุกรรมในพืชเพื่อปรับแต่งสายพันธุ์ (GMO), การค้นคว้าหายาตัวใหม่ (Drug discovery), การพิสูจน์หลักฐานทางนิติวิทยาศาสตร์ (Forensic science), การวินิจฉัยโรค (Diagnostic) จนถึงการรักษาด้วยยีน (Gene therapy) และการศึกษาในอีกหลากหลายด้านที่เพิ่มขึ้นมาอย่างต่อเนื่อง

          ปัจจัยหลักที่มีผลต่อการศึกษาเกี่ยวกับพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตนั้นย่อมเป็น คุณภาพ และปริมาณ ของ DNA หรือ RNA ที่สกัดได้จากตัวอย่าง

โดยการวัดปริมาณ (Quantity) สามารถทำได้ดังนี้

  1. การวัดค่าการดูดกลืนแสง (absorbance) ด้วย UV-VIS spectrophotometry

เป็นการวัด ปริมาณการดูดกลืนแสงของ nucleic acid (DNA และ RNA) ที่ความยาวคลื่น 260 nm ซึ่งเป็นช่วงที่ DNA และ RNA สามารถดูดกลืนแสงได้มากที่สุด โดยจะค่าอยู่ในช่วง 0.1-1 และสามารถคำนวณเป็นปริมาณได้ดังนี้

ความเข้มข้นของ dsDNA (ug/ml) = 50 ug/ml x dilution factor x ค่าการดูดกลืนแสง A260
ความเข้มข้นของ RNA (ug/ml) = 40 ug/ml x dilution factor x ค่าการดูดกลืนแสง A260
ความเข้มข้นของ Oligonucleotides (ug/ml) = 33 ug/ml x dilution factor x ค่าการดูดกลืนแสง A260

  1. การวัดการเปล่งแสงของสีฟลูออเรสเซนต์ (Fluorescence dyes) ด้วย Fluorospectrometer

เป็นการใช้หลักการที่สีฟลูออเรสเซนต์จะเข้าไปจับกับสารพันธุกรรมเป้าหมายอย่างจำเพาะ และจะถูกกระตุ้นให้เปล่งแสงออกมา ค่าการเปล่งแสงของตัวอย่างที่ได้จะถูกเอาไปเทียบกับกราฟของค่าการเปล่งแสงของสารพันธุกรรมมาตรฐานที่รู้ความเข้มข้นแน่นอน

  1. การเปรียบเทียบความเข้มของแบน (Band Intensity) ด้วย Gel electrophoresis

เป็นการทำ Agarose gel electrophoresis หรือ Capillary gel electrophoresis แล้วเปรียบเทียบความเข้มของแบนตัวอย่างกับความเข้มของแบนสารพันธุกรรมมาตรฐานที่รู้ความเข้มข้นแน่นอน

สำหรับการวัดคุณภาพ (Quality) จะพิจารณาจาก
1. ความบริสุทธิ์ (Purity)

เป็นการตรวจวัด DNA หรือ RNA ว่ามีการปนเปื้อนสารชีวภาพต่างๆ อย่างเช่น Humic acid, Phenol, Salt รวมถึง Protein ต่างๆ ที่หลงเหลือจากการสกัดหรือไม่สามารถกำจัดออกไปได้หรือไม่ ซึ่งสิ่งปนเปื้อนเหล่านี้อาจจะส่งผลต่อปฏิกิริยาในการทดลองขั้นต่อไปได้
โดยใช้อัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ A260/A280 สำหรับวิเคราะห์สัดส่วนของ DNA, RNA และการปนเปื้อนของ Protein หรือ Phenol เนื่องจากโปรตีนสามารถดูดคืนแสงได้ที่ดีที่สุดที่ A280 โดย

การแปลผลเบื้องต้นเป็นดังนี้
- กรณีที่ A260/A280 อยู่ในช่วง 1.7-1.9 ถือว่า DNA มีความบริสุทธิ์
- กรณีที่ A260/A280 อยู่ในช่วง 1.9-2.1 ถือว่า RNA มีความบริสุทธิ์
- กรณีที่ A260/A280 อยู่ในช่วง 2.1 ขึ้นไป มีการปนเปื้อนของ Protein หรือ Phenol สูง

และใช้อัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ A260/A230 สำหรับวิเคราะห์การปนเปื้อนของสารอินทรีย์ต่างๆ ไม่ว่าจะเป็น Humic acid, Ethanol หรือ salt ต่างๆ หากอัตราส่วนของค่าการดูดกลืนแสงที่ A260/A230 มากกว่า 1.8 แสดงว่ามีการปนเปื้อน

รูปที่ 2 กราฟการวัดปริมาณ DNA หรือ RNA และวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ ด้วยเครื่อง QIAxpert

 

2.ความสมบูรณ์ (Integrity)

เป็นการทำ Agarose gel electrophoresis หรือ Capillary gel electrophoresis และตรวจวัดขนาดของ DNA หรือ RNA ซึ่งจะบอกได้ว่ายังคงมีความสมบูรณ์หรือมีการถูกย่อยสลายไปแล้ว

รูปที่ 3 การวิเคราะห์คุณภาพของ gDNA โดย QIAxcel Advance System

รูปที่ 4 การวิเคราะห์คุณภาพของ RNA โดย QIAxcel Advance System

รูปที่ 5 ตารางเปรียบเทียบเทคโนโลยีในการวิเคราะห์คุณภาพและปริมาณ

สินค้าที่เกี่ยวข้อง

          QIAxpert (https://www.qiagen.com/th/products/instruments-and-automation/quality-control-fragment-analysis/qiaxpert-system/)
          QIAxcel Advanced (https://www.qiagen.com/th/products/instruments-and-automation/quality-control-fragment-analysis/qiaxcel-advanced-system/)

เอกสารอ้างอิง

  • Haque, K.A., Pfeiffer, R.M., Beerman, M.B., Chanock, S.J., and Bergen, A.W. 2003. Performance of high-throughput DNA quantification methods. BMC Biotechnology, 3,20. DOI: 10.1186/1472-6750-3-20.

  • Sedlackova, T., Repiska, G., Celec, P., Szemes, T., and Minarik, G. 2013. Fragmentation of DNA affects the accuracy of the DNA quantitation by the commonly used methods. Biological Procedures Online, 15,5. http://doi.org/10.1186/1480-9222-15-5.

  • Schade, C. 2014. Quality Control: An Important Success Factor in Nucleic Acid-Based Analysis. American Laboratory Articles Website. www.americanlaboratory.com/914-Application-Notes/158842-Quality-Control-An-Important-Success-Factor-in-Nucleic-Acid-Based-Analysis.

สนใจสอบถามข้อมูลได้ที่

แผนก Technical Support E-mail: techsupport@biodesign.co.th หรือ Info@biodesign.co.th หรือ Line: @BioDesign หรือ https://www.facebook.com/BioDesignTH

“บทความผลิตภัณฑ์โดย Technical Support Team ”