Product Articles

คำถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับ QIAcuity Nanoplate-Based Digital PCR

Q: การทำ digital PCR จำเป็นต้องใช้ standard curve ไหม

A: Digital PCR ไม่จำเป็นต้องใช้ Standard curve มาคำนวณหาความเข้มข้นของ target gene โดย Digital PCR จะอาศัยการคำนวณโดยใช้ Poisson statistic มาคำนวณจากจำนวน positive partition, negative partition และ valid partition และปริมาตรของสารละลายในการวิเคราะห์

 

Q: มีวิธีการเตรียม DNA อย่างไรก่อนทำการทดลองด้วย Digital PCR

A: ตัวอย่าง DNA ควรมีการวัดปริมาณ (Quantity) และคุณภาพ (Quality) ก่อนลงเครื่องโดยอาศัยเครื่อง Spectrophotometer ในกรณีที่ตัวอย่าง DNA มีขนาดมากกว่า 20 kb ผู้ใช้งานควรทำให้ DNA เป็นสายสั้นก่อนโดยใช้ restriction enzyme ก่อนขั้นตอน partitioning ซึ่ง restriction enzyme จะช่วยให้ fragmented DNA กระจายไปใน partition ได้ดี ในส่วนของตัวอย่างที่เป็น plasmid นั้น restriction enzyme ก็จะช่วยคลายเกลียวจาก supercoil เป็น linearized form ทำให้ง่ายต่อการตรวจวัด

 

Q: ข้อควรระวังในการใช้งาน Nanoplate

A: เครื่อง QIAcuity จะมีการอ่านผลที่ด้านล่างของ nanoplate ผู้ใช้งานต้องระวังการไปสัมผัส หรือสร้างรอยขีดข่วนที่ด้านล่างของ nanoplate ซึ่งจะส่งผลต่อการอ่านสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ของตัวอย่างได้ วิธีการป้องกันคือวาง nanoplate บน nanoplate tray หรือพื้นผิวที่เรียบ หลีกเลี่ยงฝุ่นละออง สัมผัส nanoplate บริเวณด้านข้างในขั้นตอนการนำเข้าเครื่อง QIAcuity

 

Q: สามารถใช้ real-time PCR master mix ร่วมกับ QIAcuity Digital PCR ได้หรือไม่

A: ไม่สามารถใช้ real-time PCR master mix ร่วมกับ Digital PCR ได้ เนื่องจากการวิเคราะห์ผลของ digital PCR จำเป็นต้องอาศัยจำนวนของ valid partition ที่ได้มากจาก reference dye ในน้ำยาของ QIAcuity dPCR master mix ทั้งระบบ probe และ Evagreen แต่อย่างไรก็ตาม ผู้ใช้งานสามารถใช้ probe-primer ที่เคยใช้กับงาน real-time PCR มาใช้กับ digital PCR ได้

 

Q: สามารถทำ gradient temperature ได้หรือไม่

A: ในกรณีที่ผู้ใช้งานต้องการ optimization อุณหภูมิของการทำ dPCR ผู้ใช้งานสามารถ optimization บนเครื่อง real-time PCR ก่อนได้ แล้วจึงค่อยนำ temperature profile นั้นมาใช้งานร่วมกับเครื่อง QIAcuity เพราะ QIAcuity ยังไม่รองรับการทำ temperature gradient จากเครื่อง PCR ภายในเครื่องได้

 

Q: จุดประสงค์ของ reference channel ใน digital PCR คืออะไร

A: Reference channel เป็นช่องสัญญาณที่ใช้สำหรับการตรวจวัด reference dye ภายใน nanoplate โดยหน้าที่ของ reference dye จะทำหน้าที่ในการบอกขอบเขตุ และจำนวนของ partition ที่เราสร้างได้ในการทดลองนั้นๆที่เรียกว่า valid partitions ซึ่งในการคำนวณหาความเข้มข้นของ target gene QIAcuity software suite จะทำการคำนวณ copy/uL โดยอาศัย positive partition, negative partition และ valid partition คำนวณร่วมกับ analysis volume

 

Q: ระบบ Nanoplate based แตกต่างจากระบบ Droplet อย่างไร

A: Nanoplate และ Droplet เป็นหลักการแบ่ง digital PCR reaction จาก 1 กลายเป็นหลายหมื่น reaction ย่อยเหมือนกัน droplet จะเป็นวิธีการที่ใช้หยดน้ำมันห่อหุ้ม dPCR reaction ไว้โดยอาศัยเครื่อง Droplet generator ส่วน nanoplate จะเป็นระบบ solid partitioning โดยที่ภายใน nanoplate จะมีห้องย่อยๆรองรับหลายๆหมื่น reaction โดยข้อดีของระบบ solid partitioning คือป้องกันการรวมกันของ partition ที่อาจจะส่งผลต่อจำนวน positive partition ที่ได้จากการอ่านของเครื่องลดลง ทำให้ค่าความเข้มข้นของยีนเป้าหมายน้อยกว่าความเป็นจริง
 

สนใจสอบถามข้อมูลได้ที่

https://www.biodesign.co.th/service/article_detail/1  หรือติดต่อแผนก Technical Support E-mail: techsupport@biodesign.co.th หรือ Info@biodesign.co.th หรือ https://www.facebook.com/BioDesignTH

 

“บทความผลิตภัณฑ์โดย Technical Support Team ”